服務熱線
400-1016-218
transwell遷移/侵襲實驗
來源：萬物生物 發(fā)布時間：2021-11-02
transwell遷移/侵襲實驗
細胞遷移與侵襲實驗將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，應用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。
遷移實驗（cell migration assay）
實驗步驟：
（1）所有細胞培養(yǎng)試劑和Transwell chamber 放在37℃溫育；
（2）待測細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細胞，用PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為2×105 /ml；
（3）在下室（即24孔板底部）加入600－800μl 含10％血清的培養(yǎng)基，上室加入100－150μl細胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24小時；
（4）用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預先加入約800μl甲醇的孔中，室溫固定30分鐘；
（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到預先加入約800μl Giemsa染液的孔中，室溫染色15－30分鐘；
（6）輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞；
（7）用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；
（8）顯微鏡下取9個隨機視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果
注意事項
（1）根據(jù)待測細胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-μm孔徑（如AGS細胞），如果細胞體積較大可以考慮用10-μm孔徑；
（2）根據(jù)待測細胞的遷移能力強弱調(diào)整細胞數(shù)和遷移時間。常規(guī)24-well chamber接種細胞數(shù)約為2≈5×104/well，遷移時間12≈36小時；
（3）由于Corning公司的24-Transwell內(nèi)含12個獨立的chamber，為了避免操作污染，每次實驗可預先另準備一塊24孔普通培養(yǎng)板（Corning）；
（4）如果細胞遷移能力較弱，下室液體可用3T3細胞無血清培養(yǎng)24小時獲得的上清加50μg/ml FN（Fibronectin），具體可查閱相關文獻；
（5）細胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；
（6）固定染色擦洗時動作小心，避免擦去膜底面的細胞。但一定要充分擦凈膜表面上未遷移的細胞，以免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；
（7）Chamber和膜上都無法標記，操作時應小心避免混淆實驗組和對照組；
（8）充分晾干，避免殘留水分導致鏡下聚焦不一致。
細胞侵襲實驗 （cell invasion assay）
操作步驟
（1）Matrigel在4℃過夜融化；
（2）用4℃預冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1mg/ml，冰上操作；
（3）在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀釋后的Matrigel，37℃溫育4－5小時使其干成膠狀；
（4）后續(xù)步驟同遷移實驗（1-8）。
注意事項
（1）Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應提前在4℃預冷；
（2）鋪膠時保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡；
（3）其他注意事項同遷移試驗。
【一站式整體科研服務，成就更高水平的科研成果】
標書基金實驗咨詢 表觀遺傳組學分析
課題實驗結(jié)題指導 細胞分子功能驗證
實驗培訓文章潤色 動物模型裸鼠成瘤
臨床檢測科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作