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CRISPR/Cas9基因敲除
來源：萬物生物 發(fā)布時間：2021-11-02
CRISPR/Cas9基因敲除
CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一種來自細(xì)菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細(xì)菌及古細(xì)菌中，CRISPR系統(tǒng)共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）共同發(fā)揮作用，而Ⅱ類系統(tǒng)只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件。
目前，來自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。Cas9蛋白（含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結(jié)合成復(fù)合物，然后通過PAM序列結(jié)合并侵入DNA，形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。 由于PAM序列結(jié)構(gòu)簡單（5’-NGG-3’），幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點，因此得到廣泛的應(yīng)用。CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物、細(xì)菌、酵母、魚類及哺乳動物細(xì)胞，是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)。
通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有與野生型RNA類似的活力，但因為結(jié)構(gòu)得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，便能夠?qū)δ康幕蜻M行操作。
作為一種新的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9有以下特點和優(yōu)勢：
1、靶向精確性更高。RNA靶向序列和基因組序列必須完全匹配，Cas9才會對DNA進行剪切。
2、可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除。
3、實驗周期短，最快僅需2個月，節(jié)省大量時間和成本。
4、無物種限制。
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標(biāo)書基金實驗咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實驗結(jié)題指導(dǎo) 細(xì)胞分子功能驗證
實驗培訓(xùn)文章潤色 動物模型裸鼠成瘤
臨床檢測科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作