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PCR
來源：萬物生物 發(fā)布時間：2021-11-02
PCR
一、實驗原理
PCR 全稱聚合酶鏈式反應（英文：Polymerase chain reaction），是利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外大量擴增特定DNA片段的分子生物學技術，其特點是可以以微量的DNA為模板，快速擴增得到大量拷貝。原理是基于DNA 半保留復制與堿基互補配對原則，是在體外模擬DNA的天然復制過程，主要由‘變性-退火-延伸’這三個基本步驟構成，變性：DNA雙鏈在高溫條件（95℃）下解旋形成單鏈；退火：降低溫度可使引物結合到單鏈DNA上，DNA聚合酶結合到引物上；延伸：DNA 聚合酶在其最適反應溫度（72℃）開始沿著DNA鏈5'-3' 方向合成互補鏈。隨著PCR 的進行，生成的DNA本身將作為模板，從而啟動鏈式反應，原始DNA模板被指數(shù)擴增。
二、實驗試劑
Taq酶，M-MLV逆轉錄酶，dNTPs， DEPC處理水，雙蒸水
三、實驗儀器
電泳儀， PCR儀，高速離心機，移液器，電泳儀，電泳槽，紫外分析儀
四、操作步驟
1．cDNA的合成
逆轉錄體系的組成：
2．PCR擴增特異性片段
25ul PCR體系的組成：
五、實驗注意事項
整個操作始終注意避免RNA酶的污染；
PCR反應靈敏，注意避免試劑污染；
酶易失活，整個操作注意在冰上進行。
設立對照：陽性對照：陽性模板，陰性對照：陰性模板，試劑對照：除模板外的所有組分。
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